一、關鍵步驟
組織取材與處理
取材于胃組織肌層，需剝離黏膜、外膜及結締組織，保留中層環形肌。用含雙抗的PBS清洗3次，去除血污及雜質。若懷疑污染，可置于含青鏈霉素的混合液中浸泡30~60分鐘。
組織塊剪切與消化
將組織剪成1mm³小塊，采用兩步消化法：先加0.2%膠原酶-Ⅱ于37℃消化1小時，待組織呈絮狀后，再加0.25%胰蛋白酶消化15~30分鐘，期間每隔10分鐘搖動一次。消化后通過200目濾網過濾，收集濾液。
細胞接種與培養
濾液1000rpm離心5分鐘，棄上清，用含15%FBS的DMEM培養基重懸細胞，按5×10?cells/瓶接種至T25培養瓶。置于37℃、5%CO?培養箱中靜置培養，每2~3天換液一次。
二、成功率提升策略
優化消化條件
膠原酶與胰蛋白酶聯合使用可提高細胞釋放效率，但需嚴格控制消化時間，避免過度消化導致細胞損傷。建議通過顯微鏡觀察組織塊邊緣細胞游出情況，及時終止消化。
接種密度控制
初始接種密度以5×10?cells/瓶為宜，密度過低會導致細胞間促生長信號不足，密度過高則引發營養競爭。傳代時按1:2比例分瓶，保證細胞生長空間。
培養環境管理
使用預熱的培養基，避免溫度波動影響細胞代謝。培養箱需定期校準CO?濃度（5%）及濕度（95%），防止細胞脫水或酸堿失衡。
污染防控
操作全程在超凈工作臺內進行，器具需高壓滅菌。培養瓶口消毒后開啟，避免直接接觸瓶口。若發現污染，立即棄用并消毒環境。
細胞純度鑒定
通過CD31免疫熒光檢測細胞純度，確保目標細胞占比≥90%。定期觀察細胞形態，排除成纖維細胞等雜質干擾。
